Окрашивание срезов
Общие сведения. Окраска гистологических срезов основана на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям. Ядра клеток более способны окрашиваться основными, протоплазма — кислыми красками. Соответственно этому различают основные, или ядерные, и кислые, или диффузные, краски. Наиболее часто в обычной ветеринарной патологоанатомической практике применяются окраски срезов гематоксилин-эозином по Ван-Гизон, по Перлсу, Суданом III и др.
Окраска гематоксилин-эозином. Окрашивание ведется в маленьких чашках Петри или на стеклах. Этот метод применяется для окраски срезов, приготовленных любым способом. При этом ядра клеток приобретают фиолетово-синий или густо-синий цвет. Протоплазма и волокнистое вещество приобретают светло-синий или розово-красный цвет. Жиры и липоиды не окрашиваются. Эритроциты млекопитающих, поскольку они ядер не содержат, окрашиваются только эозином.
Окраска в чашках производится следующим образом.
1. Срез переносят препаровальной иглой из воды в раствор гематоксилина на 2—5 минут.
2. Промывают в воде 2—5 минут.
3. Погружают на 10—2(1 секунд в 1 % раствор соляной кислоты на 70° спирте (если срез сильно перекрашен гематоксилином, его следует держать в этом растворе несколько дольше).
4. Промывают в чистой воде 5—10 минут.
5. Промывают в слабощелочном растворе (в баночку с водой прибавляют 1—2 капли нашатырного спирта) 10 минут.
6. Промывают снова чистой водой в течение 10—15 минут. Если срез после щелочной воды недостаточно промыт, он плохо окрашивается эозином.
7. Окрашивают эозином в течение 3—5 минут.
8. Промывают в течение 1—2 минут водой.
9. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости — 75, 90, 100°. Если срез перекрашен эозином, его следует несколько дольше держать в 75° спирте.
10. Просветляют в карболксилоле.
11. При помощи шпателя и иголки срез переносят на предметное стекло.
12. Высушивают фильтровальной бумагой.
13. На срез наносят каплю пихтового бальзама и накрывают покровным стеклом.
Окраска по Ван-Гизон.
Окраска по Ван-Гизон дает неодинаковый цвет различных тканей. Соединительная ткань красится в ярко-красный цвет, остальные ткани — в желтый или серовато-желтый. Ядра окрашиваются в черный или темно-фиолетовый цвет.
Окраска производится следующим образом.
1. Срезы интенсивно окрашивают гематоксилином (лучше гематоксилин Вейгерта) и споласкивают в воде.
2. Сразу переносят в пикрофуксин на 3—5 минут (смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты — 150,0 и насыщенного водного раствора кислого фуксина — 3,0—5,0).
3. Быстро промывают в воде (вода извлекает из среза фуксин).
4. Обезвоживают 95° спиртом 1—2 минуты.
5. Просветляют в карболксилоле и заключают в пихтовый бальзам, как при окраске гематоксилин-эозином.
Окраска Суданом III.
Судан III — нейтральная азокраска, растворимая в спирте, ацетоне и жирах, не растворимая в воде. Окраску Суданом III производят для определения в срезах жиров и липоидов. Техника окраски следующая.
1. Замороженные срезы переносят из воды на 0,5—1,0 минуту
в 50° спирт.
2. Срезы помещают в свёжефильтрованный раствор Судана
на 10—20 минут.
3. Споласкивают 50° спиртом в течение 0,5—1,0 минуты.
4. Тщательно промывают водой в течение 10—15 минут.
5. Срезы подкрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха или Бемера.
6. Промывают водой в течение 3—5 минут. Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют в 1 % водном растворе соляной кислоты, споласкивают подщелоченной водой, затем чистой водой.
7. Заключают в глицерин или глицерин-желатину.
8. Накрывают покровным стеклом.
Окраска по Перлсу.
При некоторых заболеваниях, сопровождающихся усиленным распадом эритроцитов в кровяном русле (гемоспоридиозы, инфекционная анемия лошадей и некоторые другие) наблюдается появление железосодержащего пигмента — гемосидерина — в органах, где он обычно не встречается. Для выявления его применяется реакция на берлинскую лазурь (по Перлсу).
Техника окраски следующая.
1. Срезы из дистиллированной воды переносят стеклянными иглами в свежеприготовленную смесь, состоящую из 2% раствора желтой кровяной соли — 1 часть, и 1 % водного раствора соляной кислоты — 1,5 части на 15—20 минут.
2. Промывают дистиллированной водой в течение 5—10 минут.
3. Докрашивают квасцовым кармином 15—20 минут.
4. Ополаскивают в воде и проводят через спирты, карболксилол и бальзам.
Железосодержащий пигмент — гемосидерин — приобретает синевато-зеленоватый или голубоватый цвет.
Окраска по Туревичу.
По способу Туревича окрашивают срезы, изготовленные из мозга, для диагностики бешенства.
При этом тельца Негри и эритроциты окрашиваются фуксином в красный цвет, нервные клетки гематоксилином — в синий.
Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога и мозжечка, фиксируют их в 10% формалине, ацетоне или жидкости Адуцкевича следующего состава: 80% уксусной кислоты — 1 часть, хлороформа — 2 части, 96° этилового спирта — 6 частей.
Продолжительность фиксации при комнатной температуре в формалине 1 сутки, в ацетоне и жидкости Адуцкевича— 3—6 часов. После фиксации вырезают кусочки толщиной не более 1—1,5 мм,
заливают в парафин, после чего готовят гистологические срезы, высушивают и окрашивают.
Окраска по Туревичу производится следующим образом.
1. Срезы перед окраской депарафинируют в ксилоле 10—20
минут.
2. Смывают спиртом.
3. Окрашивают ядра клеток гематоксилином Вейгерта в течение 2 минут.
4. Срезы промывают водой.
5. Дополнительно окрашивают 1% раствором кислого фуксина в течение 1 минуты.
6. Промывают водой
7. Дифференцируют в смеси 95° спирта и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты в течение 10—20 секунд до ясно-желтого оттенка.
8. Высушивают фильтровальной бумагой.
9. Обезвоживают абсолютным спиртом.
10. Просветляют в ксилоле в течение 1 минуты.
11. Заключают в канадский, или пихтовый, бальзам.